灵芝及孢子粉的一个重要功能是调节免疫系统，然而，其作用机制还不是十分清楚。程序性细胞死亡蛋白1 (Programmed cell death protein 1,PD-1)是存在于多种免疫细胞(如B细胞和t细胞)中的一种膜蛋白，在调节免疫应答中具有重要作用。本研究分析了PD-1蛋白在去壁灵芝孢子粉介导的免疫调节中的作用。

在体外培养的人B淋巴细胞GM00130和GM02248中分析去壁灵芝孢子粉(GLE)对PD-1蛋白表达的影响。结果表明，GLE（0.5mg/ml）处理48小时可显著降低GM00130和GM02248细胞中PD-1蛋白的表达水平（图1）。

免疫荧光结果显示，GLE可降低PD-1+B淋巴细胞GM00130的比例（图2）。

实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)结果发现，GLE增加了B淋巴细胞GM00130和GM02248中pdcd-1、PD-L1 mRNA的表达水平，表明GLE抑制PD-1蛋白表达与转录抑制无关（图3）。

此外，研究还发现，GLE处理人B淋巴细胞GM00130和GM02248显著上调趋化因子CCL5蛋白的表达水平，促进免疫细胞向肿瘤位点聚集（图4）。

这些结果提示PD-1蛋白是去壁灵芝孢子粉发挥免疫调节作用的重要靶点，而GLE介导的PD-1蛋白减少并不是由pdcd-1基因的转录抑制引起的。研究表明，去壁灵芝孢子粉可发展为以PD-1蛋白为靶点的新型免疫调节剂，用于治疗肿瘤等多种疾病。

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的原发性骨恶性肿瘤。传统化疗和外科手术对其有一定的治疗作用，但由于肿瘤的快速生长和早期转移，患者的总体生存率并不理想。免疫疗法是近年来新发展的癌症治疗方法，作为一种新颖的免疫检查点调节剂，PD-L1单克隆抗体显示出优异的临床疗效。然而，PD-L1单克隆抗体存在治疗成本高、耐药的缺点。近年来的临床和临床前研究发现，同时应用多种免疫检查点抑制剂可增加患者耐受性，达到更好的抗肿瘤疗效，但不良反应也随之增加。因此，加强免疫疗法的疗效、降低免疫疗法的不良反应对于免疫疗法的进一步临床应用具有重要意义。本研究对去壁灵芝孢子粉抑制骨肉瘤的作用机制进行了研究，并评价了去壁灵芝孢子粉与PD-L1抗体协同抗肿瘤的疗效。

采用CCK-8法检测BSGWE对骨肉瘤HOS、K7M2细胞增殖的影响，采用划痕实验检测BSGWE对HOS、K7M2细胞的迁移能力的影响，采用流式细胞术检测BSGWE对HOS、K7M2细胞凋亡的影响，采用免疫印迹法检测去壁灵芝孢子粉（BSGWE）对PD-L1蛋白表达的影响及其调控机制。本研究还在裸鼠移植瘤中分析BSGWE的体内抗骨肉瘤作用，采用活体生物发光成像系统观察BSGWE对肿瘤生长和转移的影响，采用免疫组化法检测肿瘤组织和脾脏中PD-L1的表达水平及STAT3磷酸化水平。

研究结果显示，去壁灵芝孢子粉（BSGWE）可显著抑制HOS和K7M2细胞增殖、迁移，并诱导HOS、K7M2细胞发生凋亡（图5）。

免疫印迹法结果表明，BSGWE可呈浓度依赖性抑制HOS、K7M2中PD-L1的表达水平（图6A）。进一步的研究发现，BSGWE可呈浓度依赖性下调STAT3蛋白的磷酸化水平，而STAT3激动剂colivelin可逆转BSGWE对PD-L1蛋白的抑制作用。表明BSGWE通过抑制STAT3的磷酸化，从而抑制HOS和K7M2中PD-L1蛋白的表达。（图6B）。

随后，本研究在Balb/c裸鼠骨肉瘤移植瘤模型中分析BSGWE的抗肿瘤作用。结果显示，BSGWE可显著抑制移植瘤的生长，降低移植瘤的肿瘤和体积，且PD-L1单克隆抗体和BSGWE联用显示出更好的抗肿瘤作用；结果还显示，PD-L1单克隆抗体可显著降低小鼠的体重，而BSGWE与PD-L1单克隆抗体联用可有效缓解小鼠体重损失，表明BSGWE可降低PD-L1单克隆抗体治疗的副作用（图7）。